Annexe 3 : Test Elisa Sandwich Indirect

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1- Coating des plaques
Diluer l’Ac dans le tampon coating (carbonate) pH9,6, déposer 100μl par puits sur les 60 puits
du milieu; dans notre cas l’Ac = IgGs anti RYMV Mg purifiées au 1/1000
Incuber 2 heures à 37°C dans un environnement humide.

2- Lavages
Laver les puits du milieu.
Faire un lavage rapide puis 3 lavages de 3 minutes avec du PBST.
Sécher les plaques.

3- Blocage des sites non occupés
Déposer 200 μl de lait écrémé à 3% dans du PBST par puits dans toute la plaque.
Incuber 1heure à 37°C.

4- Lavages
Laver toute la plaque.
Faire un lavage de 3 min avec du PBST.
Sécher les plaques.

5- Dépôt des antigènes
Déposer 100 μl par puits dans les 60 puits du milieu. dans notre cas les antigènes sont les
broyats de riz dans du PBST au 1/1000
Incuber 2 heures à 37°C ou 1nuit à 4°C.

6- Lavages
Laver les puits du milieu.
Faire un lavage rapide puis 3 lavages de 3 minutes avec du PBST.
Sécher les plaques.

7- Dépôt de l’anticorps
Déposer 100 μl d’anticorps(surnageant) dilué dans du PBST par puits.
dans notre cas, les anticorps =ac RYMV monoclonal Mg différents dilués à différentes
dilutions.
Incuber 2heures à 37°C ou 1nuit à 4°C.

8- Lavages
Laver les puits du milieu.
Faire un lavage rapide puis 3 lavages de 3 minutes avec du PBST.
Sécher les plaques.

9-Dépot du conjugué
Déposer 100 μl d’anticorps conjugué dilué dans du PBST par puits dans les 60 puits du
milieu.
dans notre cas l’ac conjugué = IgGs anti souris diluées au 1/8000.

10- Lavages
Laver les puits du milieu et la ligne du haut.
Faire un lavage rapide puis 3 lavages de 3 minutes avec du PBST.
Sécher les plaques.

11- Dépôt du substrat
Dissoudre les tablettes de pNPP dans du tampon diéthanolamine pH9,8 (1tablette pour 5 ml
de tampon).
Déposer 100 μl par puits dans les puits du milieu et la ligne du haut(elle sert de blanc).
Incuber à l’obscurité et à température ambiante pendant 1heure.
Lire la DO à 405 nm.

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