Annexe 1 : Protocole du test ACP ELISA

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1. Mettre 200 μl d’antigène (0.1g/ml) (sève de l’échantillon broyé dans une solution tampon) dans chaque puits de la plaque ;

2. Laisser incuber la plaque à 37 °C pendant 1 heure ;

3. Mettre le PBS-T (Phosphate Buffer Saline-Tween) dans les puits de la plaque et
attendre 4 minutes avant de rincer. Répéter le lavage 2 fois. Eponger la plaque sur un papier buvard ;
Mettre dans chaque puits 200 μl d’une solution de 1% de lait écrémé en poudre (Bovine Serum Albumin: BSA) ;

4. Laisser incuber à 37 °C pendant 1 heure. Ne pas laver. Jeter le contenu de la plaque et l’éponger sur le papier buvard ;

5. Préparer l’anticorps polyclonal de RYMV en diluant au 1/1000 de PBS et ajouter 200 μl dans chaque puits de la plaque ;

6. Laisser incuber à 37 °C pendant 2 heures ;

7. Jeter le contenu de la plaque et mettre le PBS-T dans les puits de la plaque et attendre 4 minutes avant de rincer. Répéter le lavage 2 fois. Eponger la plaque sur un papier buvard

8. Ajouter 200 μl/puits de goat anti-mouse ou goat anti-rabbit alkaline phosphatase conjugate à 1/1000 de dilution dans le tampon conjugué ou conjugate buffer ;

9. Laisser incuber à 37 °C pendant 2 heures ;

10. Mettre le PBS-T dans les puits de la plaque et attendre 4 minutes avant de rincer.
Répéter le lavage 2 fois. Eponger la plaque sur le papier buvard ;

11. Ajouter 200 μl/puits de 1.0 mg/ml de p-nitrophényl phosphate dans la solution tampon du substrat;

12. Incuber à la température ambiante pendant 30 minutes ;

13 Passer la plaque au lecteur ELISA (460 nm, Metertech Σ 960).

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